问题描述

以胞吐和胞吞为代表的囊泡循环过程是细胞最基本、最重要的生命活动之一，是神经信号传递、细胞物质交换、细胞通讯、细胞迁移等不同细胞活动的基础。胞吐是由Ca2+触发的分泌囊泡与细胞膜融合并将其化学物质释放到胞外的过程。胞吞则是将膜脂、膜蛋白及胞外溶液以囊泡形式转运至胞内的过程，包括网格蛋白介导的胞吞、kiss-and-run、巨胞吞等多种内吞途径。内吞囊泡融合至早期内涵体，再由内涵体出芽形成新的分泌囊泡，以资循环和再利用。囊泡循环及其动态平衡过程经历了多次关键的膜融合与膜分裂事件，如分泌囊泡与细胞膜的融合过程（胞吐）、细胞膜内陷结构的形成与内吞囊泡分裂过程（胞吞）、内吞囊泡与早期内涵体的融合过程及循环内涵体分生出新的分泌囊泡等，这些关键的膜融合与膜分裂事件是决定囊泡循环速度与囊泡命运的限制因素，也是决定细胞囊泡系统动态变化特征及内膜稳态精密调控的关键所在。

问题背景

分泌囊泡与质膜融合的胞吐过程包括分泌囊泡的锚定、激活、融合及融合孔扩张等过程，突触结合蛋白synaptotagmin（Syt）是起始囊泡融合与神经分泌的Ca2+感受器和分子开关，SNARE蛋白复合体是介导囊泡与质膜融合并为之提供动力的核心蛋白机器。胞吞过程与胞吐紧密偶联，主要包括膜内陷结构的起始、形成，内吞囊泡与质膜分离、网格蛋白去包被、内吞囊泡再酸化等过程。然而，由于缺乏有效的超高分辨动态成像及其它检测手段，内吞囊泡与早期内涵体的融合过程、早期内涵体向晚期内涵体及循环内涵体的动态转变过程、及分泌囊泡从循环内涵体上的出芽、膨大及分裂过程及相关研究相对薄弱，其单囊泡分辨率的动态变化过程尚不清楚，其相应的调控机制还知之甚少。因此，深入系统研究囊泡循环过程中关键膜融合与膜分裂事件的动态特征及其调控机制仍是本领域最重要、最基础的关键科学问题之一。

最新进展（截止问题发布年度）

突触结合蛋白Syt，依据其对Ca2+的结合能力，可分为Ca2+依赖性Syt（Syt1、2、7等）和Ca2+非依赖性Syt（Syt4、11等）。Ca2+依赖性Syt是触发囊泡与质膜融合的Ca2+感受器，并可促使质膜发生弯曲形变、降低膜融合的能量壁垒，促进囊泡与质膜的融合，还可通过与Stonin-2、AP-2等内吞衔接蛋白的相互作用调控网格蛋白介导的胞吞过程。同时，Ca2+非依赖性Syt也定位于囊泡循环通路中，参与相关膜融合与分裂的动态调节。因此，Syt在囊泡循环与内膜稳态调节的每一个关键膜融合与膜分裂过程中均发挥着重要/关键的调控作用。

我们对胞吐、胞吞及囊泡循环的调控机制进行了系统研究，发现一种全新的完全不依赖于Ca2+的分泌模式（CiVDS），并揭示其分子机制（J Cell Biol 2016，2020; Neuron 2017; PNAS 2019）；发现胞外Ca2+信号、胞内局部Ca2+信号对囊泡融合孔开放动态过程及神经递质“量子分泌”的调控作用，并揭示Syt7作为Ca2+感受器对囊泡融合模式的调控机制（Cell Calcium 2014; Sci Signal 2019; Neuron 2019; J Neurosci 2019），提出囊泡融合孔开放的‘推拉调控模型’；发现胞吞作用的首个负向调控蛋白Syt11，并提出胞吞作用的刹车机制（EMBO Rep 2016; Front Mol Neurosci 2017; Nat Commun 2018; Neuroscientist 2020）；并进一步发现钙离子及局部神经环路对囊泡循环与囊泡库再募集的调控机制与病理意义（Nat Commun 2014; Diabetologia 2015; Analyst 2015; Front Neurosci 2019; Brain 2019）。这些最新的研究进展为正确和深入理解胞吐、胞吞及其它膜融合与膜分裂的调控机制奠定坚实的基础。

我们近期研究结果表明，虽然Ca2+依赖性Syt1、2、7是触发Ca2+依赖性囊泡分泌的重要机制，但Ca2+非依赖性Syt4和Syt11对囊泡分泌均具有显著的抑制作用；虽然Syt1和Syt7可通过扩张囊泡融合孔大小来促进全融合分泌，但Syt4和Syt11却可抑制囊泡融合孔开放、进而促进Kiss-and-run的亚量子分泌模式；尽管Syt1可通过与AP-2结合促进clathrin介导的胞吞，但Syt11则通过抑制膜内陷结构的形成抑制clathrin介导的胞吞和巨胞吞过程。更有意思的是，我们发现，Syt1虽能促进具有较高弧度的小直径膜内陷结构的形成，进而加速clathrin介导的胞吞过程，但令人惊奇的是，Syt1对具有较大膜内陷结构的巨胞吞过程则具有显著的抑制作用，提示Syt1对胞吞的调节作用与所对应胞吞模式的膜内陷结构的弯曲度密切相关。因此，Ca2+结合Syt作为正向调控因子，而非Ca2+结合的Syt作为负向调控因子，他们协同作用来精细地调节胞吐、胞吐及其它膜融合与膜分裂事件，以确保其准确而高效地响应不同生理状态与刺激模式下的内膜稳态需求。

然而，这些Syt蛋白对膜融合与膜分裂事件不同调控作用的分子基础及其协同作用模式目前仍不清楚，尤其是Syt蛋白中C2结构域与Ca2+的结合在胞吐-胞吞过程发挥双向调控作用的分子基础尚不明确。考虑到胞吐和胞吞都经历了相似的膜内陷结构形成及膜中间结构动态转变过程，且Syt蛋白可感应膜弧度变化、并可钙依赖性地插入质膜中对其进行重塑，我们推测，C2结构域与Ca2+的结合引起的构象变化在其感应膜弯曲并进一步重塑细胞膜结构方面的能力可能是决定其对胞吞和胞吐双向调控作用的关键：Syt的C2结构域结合Ca2+后可促进膜弯曲的形成，进而促进胞吐发生、囊泡融合孔扩张、胞吞膜内陷结构形成及胞吞动态过程等，而未结合Ca2+的C2结构域因无法插入质膜深层而抑制膜的弯曲形变，进而对膜融合与膜分裂起抑制作用。尽管如此，Syt蛋白感应及诱导膜弯曲形变能力的差异是否可以决定其在膜融合与膜分裂过程中不同的调控作用及机制尚不清楚。

重要意义

以Syt蛋白与膜重塑作用为主线，以囊泡循环中的膜融合与膜分裂调控机制为核心，创新电生理与电化学量子分泌检测、TIRF胞吐-胞吞成像、超高分辨囊泡动态STED成像及冷冻电镜三维重构等研究方法，在原子-分子及单囊泡水平上系统研究：（1）钙离子、局部钙信号及Syt蛋白对胞吞、胞吞、内吞囊泡与早期内涵体的融合、分泌囊泡从循环内涵体上的出芽、膨大及分裂过程等的调节作用与机制；（2）囊泡融合孔开放、融合孔扩张与闪烁、膜内陷结构起始、形成、分裂、转运等阶段Syt、网格蛋白、支架蛋白等的空间定位、组装模式、分子取向与构象变化等，原位揭示胞吐、胞吞过程核心调控蛋白的空间网络构架与动态变化；（3）Syt-质膜互作模式及其对不同膜结构的重塑效应、结构基础与分子机制；（4）Syt及其膜重塑效应在囊泡融合孔开放、扩张与闪烁及内吞孔形成与紧缩等过程中的关键作用与分子机制；（5）及其在神经发育（精神分裂症）与神经退行（帕金森病）中的病理意义。在原子-分子水平上对Syt蛋白结构-动态变化-功能以及Syt与细胞膜相互作用的系统研究将为其在调控融合孔形成、开放与扩张以及膜内陷结构的形成与内吞模式的选择等提供理论基础，为深入理解胞吐、胞吞、囊泡循环及其他膜融合与膜分裂事件的动态过程与调控机制奠定基础，并为细胞内膜系统动态变化及稳态平衡的调控机制提供重要依据。